检验笔记 | 真菌检测中常见问题专家解答

近年来，随着恶性肿瘤的高发、艾滋病的流行、化疗药物、广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等药物的广泛使用，以及人工导管等侵入性操作、器官移植等有创诊疗技术的应用，由真菌所引起的感染日益成为临床各科室面临的巨大挑战。为了提高临床诊断水平，加强真菌的检验能力显得至关重要，现在临床微生物实验室有关真菌检验的常见问题汇总如下，供大家学习参考。

1、为什么培养要设定35℃？

实验室通常将孵箱温度设定为35℃，是为了防止温度的波动对细菌或真菌生长的影响。临床常见细菌的最适生长温度为33~37℃(嗜热，嗜中温菌除外，占少数)，设定为35℃时上下波动2℃对培养无影响，如设定为37℃C显然就不合适了。至于真菌培养,要视标本来源而定。一般怀疑浅部真菌感染的标本如皮屑、甲屑、头屑及毛发等分离培养于26~28℃。来源于人体深部组织的标本如痰、胸腹水、血及骨髓深部脓肿等,建议放35℃培养,是刚离体的标本在35℃更接近于人体温度,其次临床最常见的白念珠菌在35℃能形成更为典型的伪足样菌落,这与血清出芽试验在35℃做是同样的道理。同时,来源于35℃初分离的光滑念珠菌具有更高的酶活性。怀疑温度型双相真菌感染或个别真菌需要较高温度生长时则需要两种温度同时培养。还要注意培养环境的湿度,一般要求大于60%,如果培养箱的湿度不够,最好在平板附近放置盛有无菌水的容器以保证湿度。

2、CO2对真菌生长影响大吗?

真菌属于异养型微生物，主要从有机化合物中获得碳源,而自养型微生物才需要从CO2中获得碳源，所以真菌一般不需要在二氧化碳环境中培养，而且CO2对真菌的生长和繁殖均不利,但一定浓度可刺激孢子形成。

3、在血培养中培养出真菌2次，但是患儿没有临床表现，而且临床也没用抗真菌药患儿就好了，是考虑污染吗?

这种情况要判断是否为污染菌，调查采血过程是否规范、血瓶转运过程是否符合要求、针孔是否适当封口、转运箱是否受到污染等众多因素，最关键的还是患者的临床表现，如没有真菌感染的症状，要么考虑污染，要么考虑定植(可能性不大)。

4、我们基层医院实际工作中做阴道分泌物真菌培养，生化鉴定几乎做不了，很多直接报白念珠菌，这样合适吗？

这样做不合适。目前有些检验科甚至分不清酵母菌和霉菌，在阴道白带、尿液和粪便中镜检发现念珠菌后报告为“找到霉菌”。霉菌是指丝状多细胞真菌；酵母菌是指单细胞形态的真菌，二者不可混为一谈。阴道中感染的酵母菌大多是白念珠菌，但不排除其他酵母菌。克柔念珠菌对氟康唑和5-氟胞嘧啶天然耐药，如果遇到类似存在天然耐药的菌株，会影响后续的治疗。

5、痰标本中少量念珠菌需要在报告中体现吗?还是不报告?

标本要求和检验程序用要体现，临床医生会综合考虑。虽然白色念珠菌导致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰标本真菌培养中分离出该真菌，还是建议报告，临床医生结合影像学结果综合考虑。先进性痰标本直接涂片，标本质量合格的情况下，见到真、假菌丝或大量孢子，痰培养有真菌生长，还是要报给临床医生，临床医生会综合考虑的。至于是否要做药敏，可和医生沟通后决定。①建议留样本前5%苏打水漱口；②清晨第一口痰；③连送3d结果是否一致。最好和临床医生沟通一下,或平时对医生、护士进行标本采集方法的培训。报告之前,结合痰涂片镜检结果,备注标本质量信息及污染可能性。

6、请问一下：前几天遇到一个抽出的脓液标本，打到血培养中，报阳后涂片显示真菌孢子，转种后涂片，形态上圆形，墨汁染色阳性，但是没有莢膜，转种科玛嘉没有颜色，后有白色有点黄色，用某国产鉴定显示近平滑，药敏全耐。问题是:①这个结果可信不?②墨汁用的是普通汁有影响吗?③该如何改进?

墨汁染色是针对标本中怀疑隐球菌属的荚膜进行负染，特别是新生隐球菌才做的试验，对纯培养的隐球菌属不可作为鉴定试验。(1)将之前的脓液标本做个10%KOH湿片检，寻找真菌孢子和真、假菌丝。(2)培养结果应该是可信的，最好和临床医生沟通一下，看患者是否有症状。(3)对某国产品牌不熟悉,鉴定结果和药敏结果不好判断(4)按照全国操作规程配制念珠菌的鉴定生化管，用原卫生部质控真菌鉴定符合率还是很好的，可以考虑自配生化鉴定管，用质控真菌进行验证。(5)对每批号的某国产鉴定管用质控真菌进行验证,如果结果符合,应该没问题。(6)最好参加原卫生部微生物质控培训，无论细菌、酵母菌方面,都会帮助你提高业务水平和验证你所用的试剂质量。(7)墨汁只要粗细均匀，颗粒越细小越好，推荐曹素功墨汁，试剂公司也有印度墨汁可采购。

7、临床常见痰标本初次检出曲霉后,流程是怎么进行下去的?

(1)痰标本初次培养出丝状真菌菌落，前提是痰标本必须是新鲜的或不能立即送检应4℃冰箱保存。流程是接受痰标本→镜检→培养→鉴定。在痰标本合格的情况下,先做个10%KOH湿片镜检,低倍镜寻找真菌菌丝，是透明或暗色，是否有45度分枝。如果痰标本合格，又找到菌丝，电话联系临床，告诉医生有丝状真菌生长，怀疑是XXXX，容易的直接报告临床，难的点种沙氏琼脂平板或察氏琼脂平板，再做进步鉴定。(2)若标本不合格或合格但标本中未见菌丝，和临床医生电话沟通，告知有真菌生长，让医生综合考虑。鉴定正常进行,并报告临床,备注不排除污染可能。

8、酵母菌同化试验为什么放28℃而不是35C?同化试验和发酵试验有何区别?为什么教科书上说凡能发酵某种糖，一定能同化该糖，同化某种糖则不一定发酵该糖?

多数酵母菌体外最适生长温度为28-30℃，故其体外试验选用此温度。通话和发酵分别指真菌的有氧呼吸和无氧酵解，前者将糖类分解为二氧化碳和水，后者将糖类分解为二氧化碳和酒精等。其代谢首先进行的是有氧呼吸获得能量，再进一步进行无氧酵解，这由细菌和真菌的相关酶类决定。酵母菌多数为专性需氧菌，所以其试验设计多以糖同化试验为主。比如隐球酵母只能进行有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖而不能发酵，而酿酒酵母可将粮食发酵为酒，既发酵也同化葡萄糖。

9、鉴于目前真菌培养不是很规范，如何选择培养基、温度、报告时间和方式?请讲述实验室的具体流程。

(1)培养基：沙氏葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、脑心浸膏琼脂等适宜真菌生长的培养基，临床疑似酵母菌及酵母样菌感染，有条件实验室可平行接种显色培养基，推荐采用螺口管斜面培养法，标本处理后接种于培养基斜面中下部，真菌绝大多数为需氧菌建议平行接种两管。

(2)培养条件及报告时间：深部真菌28±1℃培养7~14d，如怀疑双相真菌感染，应同时在28士1℃及35士1℃培养。

怀疑罕见真菌慢生长真菌感染或临床已用抗真菌药物时，延长观察时间至少培养4周。

如CSF宜置28℃及35℃两个温度培养至少一周；

痰/尿/粪一般35℃48h即可，如未见丝状真菌生长，则延长培养时间；

组织标本一般30℃，2~4周。

10、是否可以用科玛嘉显色培养基作为真菌初代培养基?

可作为初代培养基之一，建议另外接种沙氏培养基或酵母氮培养基(YPDA)，SDA和YPDA一般是酵母样菌的标准培养基。

11、咽拭子真菌培养有意义吗?

咽拭子培养真菌意义不大，存在定植除非患者有临床表现。

12、请问痰标本念珠菌定植率那么高，痰涂片看到比较多的孢子和假菌丝要怎么报告才比较合理?

个人觉得还是要如实报告临床医生、并将标本质量是否合格告知临床医生，至于是否感染，临床医生会根据影像学资料、患者临床表现等综合考虑的。

13、患者的手上有湿疹一样的丘疹,怀疑真菌感染,请问怎么样采样好?

对于皮损类的标本采集，需要用70%的酒精先将患处消毒处理，再使用已消毒的不锈钢刮刀或外科手术刀在皮损边缘刮取皮屑，装在无菌容器内送检。

14、我们用一次性手套装SDA平板可以吗?

一次性手套无论是PV还是乳胶，都会产生相对低氧的环境，而真菌是需氧菌会影响真菌的生长，不建议这样操作。

可以使用透气性好的胶带(静脉输液固定针头的)封闭平板，注意不要封太死。

15、用的墨汁在显微镜下不是均匀的黑色背景，而是一些细小黑色颗粒，这是不是墨汁的质量不好?还有,生物安全柜、超净工作台和通风柜三者有什么区别?

墨汁本身就是一些细微小颗粒加入溶媒形成的，墨汁质量的好坏在于颗粒的大小和均一性。

一般的墨汁检测隐球菌应该能观察，它只是作为背景,荚膜不染色，为透明的，背景是黑色。

生物安全柜和超净工作台的区别在于风吹的方向：

生物安全柜的风向是先垂直向下再向柜内，经过循环通过HEPA过滤后再排出，柜内形成一个相对负压的环境；

超净工作台的风向是先向下再向外吹，保证柜内的清洁无尘，通常用来配置平板和操作一些简单的分子克隆相关实验。

通风柜是通过风机将柜内的空气排到实验室外，通常用来配置有挥发性的化学品试剂，有害气体排向室外。

16、痰涂片中看到曲霉头，有多大临床意义?毛霉有没有污染可能？或者是定值？在痰里一直检查到青霉菌,没有意义吗?

如果痰标本直接镜检发现曲霉头，那就要考虑是曲霉感染。培养可以确定是哪一种曲霉。

毛霉存在污染的可能性，空气中也可以存在，但又因其高度的侵袭性，报告需谨慎，定值的可能性很小，但操作中污染的情况还是不少的。若标本合格，湿片镜检有90度分枝及粗大、不分隔的菌丝，那就要考虑感染了，否则有污染可能，最好及时联系临床医生。

青霉菌是一种条件致病真菌，如果痰中直接镜检查到菌丝，培养阳性，还是考虑感染。

17、在经验积累的初期，如何得到足够的菌株，用于练习各类染色、阅片呢?

有条件的话，最好到相关医院真菌室进修学习湿片镜检、真菌鉴定，将保存的菌株分批转种后，仔细研究其菌落颜色、大小质地等变化和镜检变化，并做好笔记。或参加医学真菌专业培训班进行系统学习。

18、如何保存真菌菌株?

最好的方法就是真空干燥、低温冻存。国际菌株保藏机构都是这种方法。

(1)将生长的斜面直接放在-10℃冷冻，表皮癣菌和许多接合菌纲菌种不可用此法保存。

(2)蒸馏水保存法：将生长在马铃薯葡萄糖培养基上的成熟的菌落，刮取菌丝体、芽孢或酵母细胞或利无菌蒸馏水冲洗斜面表面，再以吸管吸取放在无菌小管中，密封阻止蒸发，置于室温保存。

(3)另一种方法为直接加无菌矿物油至霉菌生长的琼脂斜面，至少可保存半年以上。

(4)基础液体培养基中加入15%~30%甘油，将新鲜成熟菌落挑至其中，-80℃保存。

19、一般什么样的患者我们会重点去关注是否为真菌感染呢?

免疫缺陷病患者、器官移植患者、肿瘤患者、中性粒细胞减少患者糖尿病患者及较长时间使用广谱抗生素的患者。

20、霉菌培养箱(28C)被污染后如何处理?培养基放进培养箱后很快长污染菌，尤其门上的密封条上也长菌了，怎么办?

断电后，甲醛熏蒸,5%苯酚(石炭酸)擦拭后停留30min后，清水擦拭，打开通风24h后再使用。

21、血培养中可能培养出哪些丝状真菌?哪些是污染?

血培养阳性的丝状真菌主要有组织胞浆菌、马尔尼菲蓝状菌、镰刀菌、念珠菌、隐球菌、毛孢子菌、赛多孢，人眼球组织(研磨后打入血培养瓶)里曾培养出紫色拟青霉。腹水打入血培养瓶培养出棕黑腐殖霉。

文献报告皮炎芽生菌、伊蒙菌、球孢子菌都可以从血培养里培养出来。

烟曲霉是污染的,有报告土曲霉的心内膜炎患者外周血培养出来土曲霉[ I Clin Microbiol.1998Nov;36(11):3347-51]。

22、呼吸科患者，男，61岁，诊断支气管肺炎，HIⅣ阴性，在合格痰内培养出马尔尼菲蓝状菌3+，可以诊断吗?有必要复检吗?

他肝脾大吗?是否有骨骼受累及?皮肤受累及?还是仅仅局限在肺部?患者有其他基础疾病吗?

建议重送标本，如果反复培养出马尔尼菲蓝状菌要警惕。痰中培养出马尔尼菲蓝状菌，应该可以认为是致病性真菌。

马尔尼菲蓝状菌和曲霉菌丝区别：

如果在直接的临床标本中(体内)，马尔尼菲蓝状菌是酵母样的孢子，而曲霉菌是分枝分隔成45度角的菌丝。

如果在体外28℃培养物马尔尼菲蓝状菌可为淡黄色、黄绿色，背面红色，有红色色素渗透培养基中；

而曲霉开始为白色，表面可为不同颜色的颗粒，以此区分为何种曲霉。

马尔尼菲蓝状菌可以见到帚状枝，而曲霉可以看到曲霉头。

以上内容来源：卢洪洲、钱雪琴、徐和平主编的《医学真菌检验与图解》

来源：临床检验医学

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